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ibidi|腫瘤學(xué)血管生成實(shí)驗(yàn)的操作過程

更新時(shí)間:2022-09-09   更新時(shí)間:2022-09-09   點(diǎn)擊次數(shù):1215次

  此次實(shí)驗(yàn)是以HUVEC細(xì)胞為例,來(lái)介紹腫瘤學(xué)血管生成實(shí)驗(yàn)的操作過程這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程。

  

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圖一  血管生成鏡檢圖


  實(shí)驗(yàn)步驟:


  1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠  

  1)實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4℃冰箱,使膠能過夜緩慢融化。(注意:同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel)  

  2)開始實(shí)驗(yàn)前,將Matrigel始終保持放在冰盒中?! ?/p>

  3)打開滅菌包裝,取出ibidi血管生成載玻片?! ?/p>

  4)每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

  

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  由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng),并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能打入10μl的膠,卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

  

  如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel:  

  我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

  

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  如上圖所示,垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說(shuō)明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

  

  2  凝膠 

  1)蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。  

  2)準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個(gè)濕盒?! ?/p>

  3)將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋?! ?/p>

  4)將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。  

  5)等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

  

8.png微信圖片_20220907103908.png

  

  3  鋪細(xì)胞 

  加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前,要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞,每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可?! ?/p>

  1)準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,充分混勻?! ?/p>

  2)將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出?! ?/p>

  3)每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠??! ?/p>

  4)同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿?! ?/p>

  5)蓋上蓋,靜置,一段時(shí)間后,所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

  

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  4  采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果  

  可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像,并且對(duì)其成管長(zhǎng)度,覆蓋面積,成環(huán)數(shù),結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄,并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

  

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  5  免疫熒光染色  

  根據(jù)需要,可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色?!?/p>


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  1)小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)?! ?/p>

  2)加入50μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)?!?/p>

  3)在室溫下避光孵育30分鐘?! ?/p>

  4)使用PBS清洗三次,注意,PBS要緩緩加入上孔,以免沖擊掉細(xì)胞。  

  5)使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像?!?/p>

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